低频变异检测（VAF<1%)，在临床及科研中有着广泛的应用，例如肿瘤液体活检，微生物群中低频耐药微生物检测，以及实验室细胞系污染评估等。基于聚合酶链反应（PCR）的方法，如数字PCR、等位基因特异性PCR等可用于检测少数特定位点（1个或几个）的低频变异（0.1%VAF）；NGS法可以同时对多个位点变异进行检测，然而，由于目前所有的NGS平台的平均内在误差至少为0.2%，其检测限（LOD）在1%和5%之间，基于唯一分子标签（UMI）的高深度测序法可以矫正测序中的系统误差，实现～0.1%VAF的检出限，但通常需要25,000X或更高的测序深度，即使对于中型Panel（如Guardant 36070基因Panel），每个样本测序成本也在1,000人民币以上。如此高的成本使许多研究人员、临床医生和病人无法负担。

2021年上海交通大学宋萍副教授在Nature Biomedical Engineering上发表了题为“Selective multiplexed enrichment for the detection and quantitation of low-fraction DNA variants via low-depth sequencing”的文章。其开发了一种称为多重抑制探针置换扩增技术（mBDA）的诊断方法，利用抑制探针和正向引物对不同模板杂交的热力学能差异：当模板为野生型时，抑制探针和模板的杂交更稳定，正向引物难以实现高效扩增（∆∆G=+2 kcal/mol）；而当模板是突变型时，正向引物可以将抑制探针置换掉而进行高效扩增（∆∆G=-2 kcal/mol）。利用每一轮PCR过程中对野生型模板的有效抑制和对突变型模板的特异性放大，实现对超低丰度核酸突变的高灵敏检测。该技术利用计算机强大的编程技术，优化并设计了80重的引物和探针技术，检查并避免了引物二聚体（约1.9万可能性）的形成，同时将目标扩增产物比对NCBI的参考数据库，进一步优化引物设计，降低非特异性PCR产物的扩增。

该技术的检测限最低可至0.019%，并可以将原本0.2%的突变频率经过多次PCR循环扩增到至少30%，其富集效率在150倍以上；在中靶率基本一致的基础上（mBDA 81.4% vs. 标准扩增子法 89.6%），大大降低了测序成本至少40倍；同时相比于捕获法文库构建，mBDA可将文库构建时间从24小时缩短至6h。同时该方法的抑制探针技术是目前为止最具高通量潜力的技术，一个16plex的黑色素肿瘤组织样品的panel，就可以涵盖 9个基因145个常见突变。该方法除了用于组织样品的检测，也可以实现针对cfDNA的液体活检，针对非小细胞肺癌的cfDNA的检测中，mBDA方法与UMI-based深度测序相比，其阳性一致率为78%（14/18），阴性一致率为98.6%（503/510）；在定量方面，大多数变异位点在2倍区间之内（0.5-2）；同时相比于深度测序平均25，000X的测序深度，mBDA-NGS仅需250X即可，在数据量上减少了近100倍。

该技术采用计算机技术和核酸探针技术相结合，优化探针设计，实现了核酸探针设计的高通量可编程，大大降低了检测成本，扩宽了其普适性，将促进更多的实验室以去中心化的模式开展检测，有望筛选出可能从靶向治疗中获益的癌症患者，从而让更多的癌症患者接受更有针对性的治疗。

论文链接：https://doi.org/10.1038/s41551-021-00713-0.